三，说明
线粒体 DNA提取的关键是尽可能的去掉核 DNA。本试剂盒利用差速离心到比较纯净的线粒体，再利用 DNA酶消化裂解缓冲系统等多步骤去掉核 DNA，最后得到纯净的线粒体 DNA。可用于 PCR等对纯度要求较高的实验。
本试剂盒用于从动物细胞或组织中分离出完整而纯化的线粒体。适合于动物软组织（肝或脑组织）和硬组织（肌肉）以及培养细胞线粒体 DNA的提取制备。不适合植物及其他标本的提取。
四，操作步骤
准备工作：在 DNA酶 I中加入 600ul（ 50T）或者 1100ul（ 100T）的 DNA酶反应液，适当分装后 -20度保存。线粒体裂解液保存于常温，如有沉淀 37℃水浴溶解，离心机温度下降到 4℃（2-8℃），如无低温离心机，也可以常温离心，并将离心时间为10min的改为5min，但最后所得DNA品质及产量可能会有一定影响。
1. 样本处理
a. 组织匀浆：称取 100~200 mg新鲜组织如 、脑、心肌等， PBS或生理盐水冲洗，洗净血水，滤纸吸干，用剪刀剪为碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入 1.0 mL冰预冷的 Lysis Buffer， 0℃冰浴上下研磨组织 20次；
b. 培养细胞匀浆：消化细胞， PBS洗涤， 800 × g 5~10 min离心收集细胞。计数。每次提取需要 5 × 10⁷个细胞，加入 1.0 mL冰预冷的 Lysis Buffer重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内， 0℃冰浴研磨 30~40次；
2. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管， 4℃， 1000× g 离心 5 min；
3. 取上清，加入一新的离心管中， 4℃， 1000× g 再次离心 5 min。
4．取上清，加入一新的离心管中， 4℃，  12,000 × g 离心 10 min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底；
5. 在线粒体沉淀中加入 0.5 mL  Wash Buffer重悬线粒体沉淀， 4℃， 1000× g 离心 5 min；
6．取上清，加入一新的离心管中， 4℃，  12,000 × g 离心 10 min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底；
7. 加入 100ul  DNA酶反应液重悬线粒体，吹打均匀后，再加入 10ul DNA酶 I溶液（见准备工作），混匀， 37度水浴 10min。此步为消化线粒体表面吸付的核 DNA。 4℃，  12,000 × g 离心 5 min。尽可能的弃上清，再加入 200ul TE 重悬线粒体沉淀，离心，洗去残留的 DNA酶。
8.得到的沉淀，用 100ul TE 重悬线粒体沉淀。加入 200ul线粒体裂解液，轻轻混匀（不可吹打），放置 2min左右，不超过 5min，再加入 150ul蛋白沉淀液，迅速混匀。 4℃，  12,000 × g 离心 5 min。此步骤可进一步去除核 DNA。
9．取上清，加入一新的离心管中（可选用等体积的酚 25:24:1抽提一次，再用 抽提一次，或者直接用 抽提两次，一般来说，此步可省，并不影响后续的 PCR），加入 0.6倍体积的 （如无 ，可加入 2.5倍体积的乙醇沉淀 DNA）及 10ul核酸核酸助沉剂，混匀， -20℃沉淀半小时左右（此步可省）， 4℃，  12,000 × g 离心 10 min。
10. 弃上清，再加入 1ml  70%乙醇， 4℃，  12,000 × g 离心 10 min。重复用 70%乙醇洗一次。
11. 弃上清后再次离心 1min 吸弃上清，开盖凉干约 5-10分钟。
12．加入 20-30ul  TE缓冲液 ,轻弹管底， 37度水浴 5分钟，线粒体 DNA溶解。
13. 进行 DNA电泳检测及 -20度保存，进行下步的实验。
四 注意事项：
1. 为保证获得完整及尽可能多的线粒体，匀浆条件要示： 是全程低温操作。 是快速。 ，如用条件可将匀浆后的碎片在显微镜下观察。与组织块相比，培养细胞特别是贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁，因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞。
2．线粒体 DNA本身含量很低，如果电泳检测不到，可加大上样量，用 少量的 TE溶解沉淀，或者直接进入 PCR检测。
2. 以离心力 g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此 计算离心速度。