线粒体 DNA 提取试剂盒 一，试剂盒组份

组份	D0215 (50T)	D0215 (100T)
细胞裂解液	50 mL	100 mL
线粒体清洗液	25 mL	50 mL
DNA酶I	12mg	22mg
DNA酶反应液	6ml	12ml
线粒体裂解液	10ml	20ml
蛋白沉淀液	7.5ml	15ml
核酸助沉剂	0.5ml	1ml
TE缓冲液	15ml	30ml

二，保存条件本试剂盒整体保存于 2-8度一年。使用前，在 DNA酶 I中加入 600ul（ 50T）或者 1100ul（ 100T）的 DNA酶反应液，分装后 -20度保存。线粒体裂解液使用前常温保存，如有沉淀可 37度水浴溶解，不影响使用。 三，说明线粒体 DNA提取的关键是尽可能的去掉核 DNA。本试剂盒利用差速离心到比较纯净的线粒体，再利用 DNA酶消化裂解缓冲系统等多步骤去掉核 DNA，最后得到纯净的线粒体 DNA。可用于 PCR等对纯度要求较高的实验。本试剂盒用于从动物细胞或组织中分离出完整而纯化的线粒体。适合于动物软组织（肝或脑组织）和硬组织（肌肉）以及培养细胞线粒体 DNA的提取制备。不适合植物及其他标本的提取。 四，操作步骤 准备工作：在 DNA酶 I中加入 600ul（ 50T）或者 1100ul（ 100T）的 DNA酶反应液，适当分装后 -20度保存。线粒体裂解液保存于常温，如有沉淀 37℃水浴溶解，离心机温度下降到 4℃（2-8℃），如无低温离心机，也可以常温离心，并将离心时间为10min的改为5min，但最后所得DNA品质及产量可能会有一定影响。 1. 样本处理 a. 组织匀浆：称取 100~200 mg新鲜组织如 、脑、心肌等， PBS或生理盐水冲洗，洗净血水，滤纸吸干，用剪刀剪为碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入 1.0 mL冰预冷的 Lysis Buffer， 0℃冰浴上下研磨组织 20次； b. 培养细胞匀浆：消化细胞， PBS洗涤， 800 × g 5~10 min离心收集细胞。计数。每次提取需要 5 × 10⁷个细胞，加入 1.0 mL冰预冷的 Lysis Buffer重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内， 0℃冰浴研磨 30~40次； 2. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管， 4℃， 1000× g 离心 5 min； 3. 取上清，加入一新的离心管中， 4℃， 1000× g 再次离心 5 min。 4．取上清，加入一新的离心管中， 4℃，  12,000 × g 离心 10 min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底； 5. 在线粒体沉淀中加入 0.5 mL  Wash Buffer重悬线粒体沉淀， 4℃， 1000× g 离心 5 min； 6．取上清，加入一新的离心管中， 4℃，  12,000 × g 离心 10 min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底； 7. 加入 100ul  DNA酶反应液重悬线粒体，吹打均匀后，再加入 10ul DNA酶 I溶液（见准备工作），混匀， 37度水浴 10min。此步为消化线粒体表面吸付的核 DNA。 4℃，  12,000 × g 离心 5 min。尽可能的弃上清，再加入 200ul TE 重悬线粒体沉淀，离心，洗去残留的 DNA酶。 8.得到的沉淀，用 100ul TE 重悬线粒体沉淀。加入200ul线粒体裂解液，轻轻混匀（不可吹打），放置 2min左右，不超过 5min，再加入 150ul蛋白沉淀液，迅速混匀。 4℃，  12,000 × g 离心 5 min。此步骤可进一步去除核 DNA。 9．取上清，加入一新的离心管中（可选用等体积的酚 25:24:1抽提一次，再用 抽提一次，或者直接用 抽提两次，一般来说，此步可省，并不影响后续的 PCR），加入 0.6倍体积的 （如无 ，可加入 2.5倍体积的乙醇沉淀 DNA）及 10ul核酸核酸助沉剂，混匀， -20℃沉淀半小时左右（此步可省）， 4℃，  12,000 × g 离心 10 min。 10. 弃上清，再加入 1ml  70%乙醇， 4℃，  12,000 × g 离心 10 min。重复用 70%乙醇洗一次。 11. 弃上清后再次离心 1min 吸弃上清，开盖凉干约 5-10分钟。 12．加入 20-30ul  TE缓冲液 ,轻弹管底， 37度水浴 5分钟，线粒体 DNA溶解。 13. 进行 DNA电泳检测及 -20度保存，进行下步的实验。 四 注意事项： 1. 为保证获得完整及尽可能多的线粒体，匀浆条件要示： 是全程低温操作。 是快速。 ，如用条件可将匀浆后的碎片在显微镜下观察。与组织块相比，培养细胞特别是贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁，因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞。 2．线粒体 DNA本身含量很低，如果电泳检测不到，可加大上样量，用 少量的 TE溶解沉淀，或者直接进入 PCR检测。 2. 以离心力 g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此 计算离心速度。